处理长选20世纪90年代

胭脂虫红色素是检测及波一种蒽醌类天然色素，寄生在仙人掌类植物上的食品雌性胭脂虫是提取胭脂虫红色素的原料，此种胭脂虫原产于中南美洲、中胭脂虫择墨西哥等地。处理长选20世纪90年代，研究我国首次从国外引进胭脂虫，检测及波2002年在云南省开始有规划种植胭脂虫。食品目前国际国内市场上的中胭脂虫择胭脂虫红产品主要分为三种：胭脂虫萃取液、胭脂虫红铝、处理长选水溶性胭脂虫红色素。研究胭脂虫红色素的检测及波主要成分是胭脂红酸，胭脂红酸呈极性，食品易溶于水以及甲醇、中胭脂虫择乙醇等有机溶剂，处理长选136℃会分解，研究光稳定性较好。

胭脂虫红色素因其安全的特性及美丽的颜色被广泛应用于食品。国家标准GB2760-2014中对胭脂虫红的使用限量（以胭脂红酸计）进行了要求。目前国内外主要使用分光光度法来测定食品中胭脂虫红的含量，检测波长在可见光区494nm，此方法不能排除其他在494nm下有吸收的杂质组分的干扰。随着研究的深入，反相薄层色谱（TLC）/光密度扫描分析法、高效毛细管电泳法、液相色谱法和超高效液相色谱-质谱联用法等方法被逐渐应用于胭脂虫红的测定。由于胭脂红酸在紫外光区和可见光区均有明显的吸收峰，本研究建立了高效液相色谱法，分别在两个光区选择最大吸收波长进行检测，并对检测结果进行比较，为胭脂虫红的测定提供更精准的方法。同时，针对部分含干扰物质较少的样品，从前处理方法和检测波长两方面进行摸索，建立了快速检测胭脂虫红的方法。

一、实验部分

1、仪器与试剂

高效液相色谱仪（美国Agilent，1260Infinity）；分析天平（德国Sartorius，QUINTIX224-1CN）l离心机（德国Sigma，4-16KS）；恒温水浴锅（上海精宏，DKZ-2）；旋涡振荡器（德国IKA，MS3）；聚酰胺固相萃取小柱（上海安谱，60mg/3mL）。

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。胭脂红酸（CAS：1260-17-9，德国Dr.EhrenstorferGmbH）l乙腈（德国Merck，色谱纯）；甲酸（德国Merck，色谱纯）。0.05％甲酸水溶液；2mol/L盐酸溶液；酸化甲醇（甲酸：甲醇=1:50，v:v）；氨水甲醇（体积分数为5％的氨水:甲醇=1:l，v:v），以上试剂均为广州化学试剂厂。

2、标准溶液的配制

准确称取胭脂红酸标准品0.1g（精确至0.0001g）于100mL容量瓶中，用水溶解定容，配制成质量浓度为1000mg/L的储备液。移取适量标准储备液，以水稀释成质量浓度分别为2.50、5.00、10.0、20.0、40.0、100mg/L系列标准溶液。

3、样品的前处理

（1）直接提取法

称取2g均匀后样品于50mL离心管中，之后加入2mol/L盐酸溶液10mL，混合均匀，置于80℃水浴中30min，取出充分冷却后加入15mL甲醇，振荡2min。于9000r/min转速下离心5min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤后，按色谱条件进行测定。

（2）净化法

处理方法：称取2g均匀后样品于50mL离心管中，之后加入2mol/L盐酸溶液10mL，混合均匀，置于80℃水浴中30min，取出充分冷却后加入15mL甲醇，振荡2min。于9000r/min转速下离心5min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤后，按色谱条件进行测定，待净化。取上清液5mL于15mL离心管中，加入5mL水充分混匀。用2mL酸化甲醇和2mL水活化聚酰胺固相萃取小柱，将混合液以流速1～2mL/min全部过柱，用2mL水淋洗并抽干，之后用2mL的氨水甲醇洗脱，并用15mL刻度管收集，再加入300μL甲酸，用水定容至2.50mL，混匀后用0.22μm滤膜过滤，按色谱条件进行测定。

4、色谱条件

（a）色谱柱：Agilent5TC-C185μm×4.6mm×150mm；

（b）柱温：35℃

（c）进样量：20μL；

（d）检测波长：276nm和494nm；

（e）流速：1.0mL/min；

（f）流动相：A：0.05％甲酸水溶液；B：乙腈；梯度洗脱程序见表1。

二、结果与讨论

1、检测波长的选择

采用二极管阵列检测器对胭脂红酸标准溶液在190nm～600nm范围进行吸收光谱扫描，结果见图1。观察发现胭脂红酸的最大吸收波长为276nm和494nm，本研究同时选择276nm和494nm为检测波长。

2、标准曲线的绘制与检出限

以胭脂红酸溶液的质量浓度为横坐标，以在两种波长下测得的峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线，求得回归方程。在276nm检测波长下，得到的线性回归方程为y=73.23551x-19.78479，相关系数r=0.99998；在494nm检测波长下，得到的线性回归方程为y=18.64641x+0.0428828，相关系数r=0.99997。两者在2.5～100mg/L范围内均具有良好的线性关系。直接提取法，以取样量2g计，在494nm检测波长下的检出限为10.0mg/kg（S/N＞3）；净化法，以取样量2g计，在276nm检测波长下的检出限为1.25mg/kg（S/N＞3），在494nm检测波长下的检出限为3.75mg/kg（S/N＞3）。

3、精密度实验

将浓度为20mg/L的胭脂红酸标准液连续进样6次，评估仪器的精密度，结果见表2。由表2可看出，在276nm检测波长下，标准液实测值为19.5mg/L，RSD为0.49％；494nm波长下，实测值为19.4mg/L，RSD为0.76％。

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